DSpace
 

RIUFF >
CMB - Instituto Biomédico >
MGB - Curso de Graduação em Biomedicina - Bacharelado >
MGB - Trabalhos de Conclusão de Curso >

Please use this identifier to cite or link to this item: http://localhost:8080/jspui/handle/1/5200

Title: Rastreamento molecular por pirosequenciamento de mutações relacionadas à resistência a Lamivudina em subpopulações de HBV e HIV isoladas de pacientes coinfectados
Authors: Dias, Natália Spitz Toledo
???metadata.dc.contributor.advisor???: Soares, Caroline Cordeiro
???metadata.dc.contributor.advisorco???: Lago, Bárbara Vieira do
Issue Date: 9-Nov-2017
Abstract: Aproximadamente 10% dos indivíduos infectados pelo vírus da imunodeficiência humana (HIV) são portadores crônicos do vírus da hepatite B (HBV). O monitoramento destes pacientes merece atenção especial, já que estes progridem mais rápido para cirrose e morte por doença hepática do que os monoinfectados pelo HBV. Por esse motivo, a terapia antiviral contra os dois vírus é prioritária na maioria dos casos. Algumas drogas atuam na transcriptase reversa (TR), enzima importante na replicação de ambos os vírus e, por isso, podem ser eficazes no tratamento das duas infecções. No entanto, mutações de resistência podem ser selecionadas durante a terapia, levando a diminuição da eficácia das drogas utilizadas. O objetivo deste estudo foi detectar e quantificar as mutações de resistência à Lamivudina (3TC) em populações de HBV e HIV isoladas de pacientes coinfectados, através da técnica de pirosequenciamento. Quarenta e cinco amostras de soro de pacientes HBV/HIV coinfectados foram submetidas à análise da mutação primária rtM204V/I e das compensatórias rtV173L e rtL180M do HBV e da mutação M184V/I do HIV-1. Todas as amostras foram submetidas a um ensaio de nested-PCR para amplificação de um fragmento da polimerase viral do HBV e a um RT-PCR para amplificação da região da TR do HIV-1. Vinte e cinco amostras foram amplificadas com sucesso para o HBV e submetidas ao pirosequenciamento das mutações de resistência do HBV. O RNA do HIV foi amplificado em treze amostras, que foram submetidas a análise da mutação M184V/I. O sequenciamento de Sanger da região genômica S do HBV foi realizado em 15 amostras e da região do motivo YMDD do HIV foi realizado em 2 amostras, para posterior comparação com os resultados do pirosequenciamento. A análise da mutação M204V/I foi realizada com sucesso em 23 amostras. A maioria das amostras (69,6%; 16/23) apresentou uma mistura de populações selvagens (M204) e mutantes (M204V/I). Apenas população mutante M204V foi encontrada em 21,7% (5/23) e 8,7% (2/23) das amostras estudadas eram compostas apenas por populações selvagens. A mutação V173L foi investigada em 20 amostras. Apenas populações selvagens foram encontradas em 90% (18/20) das amostras e apenas populações mutantes foram encontradas em 10% (2/20) das amostras. Nas amostras submetidas ao sequenciamento de Sanger o resultado foi o mesmo em ambos os métodos, com exceção das amostras que apresentaram população mista no pirosequenciamento, as quais o sequenciamento padrão detectou apenas as populações majoritárias. A mutação L180M foi investigada em 15 amostras e apenas cepas selvagens foram encontradas, pelo método de pirosequenciamento, no entanto, esse resultado foi desconsiderado devido a uma provável falha no oligonucleotídeo utilizado para essa mutação, uma vez que o sequenciamento de Sanger detectou 4 amostras com essa mutação. A mutação M184V/I do HIV foi investigada em 9 amostras, e apenas populações selvagens foram encontradas. O mesmo resultado foi confirmado pelo sequenciamento. O pirosequenciamento é uma técnica sensível que pode ser útil na detecção e quantificação de subpopulações de vírus resistentes, que talvez não fossem detectadas por outros métodos. Porém alguns ajustes ainda devem ser feitos para a detecção da mutação rtL180M, que foi encontrada nas amostras analisadas apenas pela técnica de Sanger. A alta sensibilidade do pirosequenciamento permite que se avalie a melhor conduta terapêutica para um paciente, pois é possível detectar a proporção de cepas selvagens e mutantes infectando o indivíduo, permitindo uma intervenção precoce durante o tratamento.
???metadata.dc.description.abstractother???: Approximately 10% of individuals infected with human immunodeficiency virus (HIV) are chronic carriers of hepatitis B virus (HBV). The monitoring of these patients deserves special attention, as they progress more rapidly to cirrhosis and death from liver disease than HBV monoinfected. For this reason, the antiviral therapy against the two viruses is a priority in most cases. Some drugs act in reverse transcriptase (RT), an important enzyme in the replication of both viruses and, therefore, can be effective in the treatment of both diseases. However, resistance mutations may be selected during therapy, leading to reduced efficacy of the used drugs. The aim of this study was to detect and quantify lamivudine (3TC) resistance mutations in isolated populations from HBV/HIV coinfected patients by pyrosequencing technique. Forty -five serum samples from HBV/HIV coinfected patients were analyzed for primary mutation rtM204V/I and compensatory mutations rtV173L and rtL180M inHBV and M184V/I mutation in HIV–1 genomes. All samples were subjected to a nested-PCR assay to amplify a fragment of HBV viral polymerase and an RT - PCR amplification of the HIV-1 RT region. Twenty-five samples were successfully amplified for HBV and subjected to pyrosequencing of HBV resistance mutations. The HIV RNA was amplified in thirteen samples, which were submitted to analysis of the M184V/I mutation. The Sanger sequencing of the HBV S genomic region was performed on 15 samples and the HIV YMDD motif was performed on 2 samples for comparison with the results of pyrosequencing. The analysis of the M204V/I mutation was successfully performed on 23 samples. Most samples (69.6%, 16 /23) showed a mixture of wild populations (M204) and mutants (M204V/I). Only M204V mutant population was found in 21.7 % (5 /23) and 8.7 % (2/23 ) of samples studied were composed only of wild populations. The V173L mutation was investigated in 20 samples. Only wild populations were found in 90 % (18/20) of the samples, and only mutant populations were found in 10% (2 /20) of the samples. In the samples subjected to Sanger sequencing it was found the same results for both methods, except for samples with mixed population in pyrosequencing, which the standard sequencing detected only the majority populations. The L180M mutation have been investigated only in 15 samples and only wild strains were found by pyrosequencing method , however , this result was disregarded due to a likely failure of the primer used for this mutation, since the Sanger sequencing detected this mutation in 4 samples. The M184V / I mutation of HIV was investigated in 9 samples, and only wild populations were found by pyrosequencing. The same result was confirmed by standard sequencing. The pyrosequencing is a sensitive technique that can be useful in the detection and quantification of subpopulations of resistant viruses that may not be detected by other methods. However, some adjustments must also be made for the detection of mutations rtL180M, which was found only in the samples analyzed by the Sanger technique. The high sensitivity of pyrosequencing enables one to evaluate the best treatment for a patient, because it is possible to detect the ratio of wild type and mutant strains infecting an individual, allowing early intervention during treatment.
URI: http://localhost:8080/jspui/handle/1/5200
Appears in Collections:MGB - Trabalhos de Conclusão de Curso

Files in This Item:

File Description SizeFormat
Natália Spitz Toledo Dias 2013.2 TCC.pdf1.56 MBAdobe PDFView/Open
View Statistics

This item is licensed under a Creative Commons License
Creative Commons

Items in DSpace are protected by copyright, with all rights reserved, unless otherwise indicated.

 

Valid XHTML 1.0! DSpace Software Copyright © 2002-2010  Duraspace - Feedback